엑솜시퀀싱과 전장유전체 시퀀싱으로 임상테스트를?

NGS는 희귀한 단일 유전자 질환의 유전적 원인을 조사하는 기술이다. 빠른 속도로 임상 진단 분야에 이용되고 있으며, 분자 진단 테스트 영역에도 활용되고 있다. 다중 유전자가 많은 NGS 기반의 테스트는 임상 실험실에서도 사용되고 있을 만큼 활용도가 높아지고 있다.

대부분 원인 유전자로 증명하기 위해 엑솜시퀀싱¹⁾을 실시하는데, 예를 들어, 열성의 신경발달 장애에 관련된 118개의 발생 원인 중 19%에서 질병을 일으키는 유전적 변이를 확인 할 수 있었다. 또한 한 연구에서는 초기 임상 진단과 환자의 10가지 발생원인에서 8%에 해당하는 유전적 변이를 발견하기도 하였다. 이 연구는 약 1000개의 핵 유전자의 미토콘드리아 DNA와 엑손²⁾을 분석하여 미토콘드리아에 관련된 질병으로 42명의 유아와 10명의 성인 환자에서 병원성 변이를 확인하였다. 또한 다른 연구에서는 12명의 환자와 가족(trio)에서 엑솜시퀀싱을 통해 2가지 새로운 질병 원인 유전자를 발견하였다.

전장유전체 시퀀싱³⁾(WGS; Whole-genome sequencing)과 엑솜시퀀싱(WES; Whole-exome sequencing)의 데이터는 차세대 시퀀싱(NGS; Next Generation Sequencing)⁴⁾ 기반의 임상 테스트의 최소한의 진단을 정의하는 기술로 임상 유틸리티가 앞으로 몇 년간 더 개선되면 환자가 향상된 진단의 정확성과 적절한 치료의 혜택을 받을 것으로 예상된다. 기존의 분자 진단 검사가 하나 이상의 유전자에 대한 엑솜의 수를 평가한 임상적 판단에 기반하였고, 유전자와 질병 사이에 알려진 인과 관계가 있는 장애에 대해서만 진단 받을 수 있었던 반면, WGS와 WES를 이용한 유전자 분석은 잠재적인 환자의 상태와 관련되어 명확한 임상 진단 없이 장애와 관련된 유전자에 대한 테스트를 해볼 수 있다는 장점이 있다. 이에 임상 진단 실험실은 적극적으로 NGS 기반의 테스트를 구현하기 위해 노력하고 있으며, 몇 가지 중요한 특징을 검토하고, 변이 진단 방법에 대한 이해를 확보하여 분석 문제를 논의 중에 있다.

NGS를 이용한 엑솜시퀀싱과 전장유전체시퀀싱

7년 전 임상 진단에 대한 커뮤니티를 감지하고 임상의 중요성에 대한 지식이 없었던 시기가 있었다. 그러나 NGS의 발달로 엑솜시퀀싱과 전장유전체 시퀀싱의 논쟁이 화두가 되었다. 두 방식은 주로 가격, 처리시간, 데이터 생성에 들이는 노력과 저장공간 등에서 논쟁이 있었다. 그러나 엑솜시퀀싱과 전장유전체 시퀀싱의 가격 차이가 좁혀져 최근에는 전장유전체 시퀀싱이 임상진단에 더 널리 사용될 예정이다.

아직은 유전자 기반의 테스트와 엑솜시퀀싱 임상 진단 방식을 사용하고 있으나, 전장유전체 시퀀싱의 잠재력은 우리가 비 암호화된 영역의 기능을 이해했을 때 실현될 것이다. 그러나 비 암호화된 영역의 기능이 ENCODE 프로젝트⁵⁾를 통해 밝혀지고 있는 만큼 그 시기가 앞당겨지고 있다. 암호화 및 비 암호화 서열은 단일 염기 다형성(SNP)⁶⁾, 유전자의 삽입과 삭제(indel)⁷⁾ 및 대형 유전자 간 copy number⁸⁾ 변종을 감지하는 데 사용될 것이다.

NGS 기반의 분자 진단 검사가 아직은 초기 단계에 있으나, 단일 유전자 질환에 대한 우수한 임상 이용을 증명할 방법으로 떠오르고 있다. 데이터 생성을 위한 NGS 기술의 발전으로 데이터 분석 및 임상 추출의 잠재력에 대한 더 많은 생물 정보학 도구를 사용하게 될 것으로, 희귀한 단일 유전자 질환의 연구에서 보여준 환자 치료의 개선은 분자 진단의 실현에 새롭고 흥미로운 방법이 될 것이다.

진단의 유효성은 있는 것인가?

시퀀싱 진단의 유효성을 확인하기 위해, 일루미나의 TruSeq(SureSelect v4)으로 965개 유전자와 378개의 엑솜을 분석하였다. BWA⁹⁾(Burrows-Wheeler Alignment)로 새로운 부위를 정렬하고 BWT⁹⁾(Burrows-Wheeler Transformation)는 대부분 BWA와 중복되지만 실질적으로는 다른 변형 세트를 형성하였다. 연구는 NGS를 기반으로 하는 엑솜시퀀싱과 전장유전체 시퀀싱은 임상 시험을 확인하고 품질 관리를 수행하여 조절 방법에 대한 중요한 의미를 가졌다.

NGS 기술이 계속 빠른 속도로 발전하며, 새로운 방법이 계속 개발되고 있어서, 철저한 검증 전에 기존의 방법은 종종 최신 버전으로 대체되기도 한다. 생어시퀀싱(Sanger Sequencing)¹⁰⁾은 분석 감도나 특이성, 재현성을 표준화하고 일관성 있게 하지만 높은 비용과 처리시간이 길어서, NGS 기술이 생어시퀀싱을 대체 할 것이다.

엑솜시퀀싱과 전장유전체 시퀀싱은 유전자의 발견과 진단 기능, 모두를 제공한다. 질병 진단의 강력한 증거로 가족력과 생물학적 메커니즘으로 새로운 변이와 표현형 사이의 인과 관계를 구축할 수 있을 것이다. 또한 비슷한 영향을 가진 환자에 암호화된 단백질의 해로운 효과를 유전자의 반복된 새로운 변이에서 발견할 수 있을 것이다.

이것이 가능한 이유는 데이터 분석 과정에서 필터링을 포함하고 있기 때문이다. 엑손에서 발생하지 않은 변종을 제거할 뿐만 아니라 이형의 변종에서 발생하지 않으면 삽입과 결실이 제거되었다. 또 나머지 변이들은 데이터베이스와 비교하여 dbSNP 같은 공공 데이터 베이스에서 발생하는 일반적인 변이들을 제거하였다. 유전적인 진단을 위해서는 부모의 샘플이 새로운 변종을 식별하기에 매우 유용하며, 우성과 열성에 대한 가족력의 후보 유전자 범위를 좁히는 데 도움이 된다. 또한 확장된 임상 진단 과정의 일부로 전사체 시퀀싱(RNA-seq)11) 및 유전자 발현 프로파일을 예측하기도 한다.

엑솜시퀀싱(Exome sequencing) : 모든 엑솜 지역을 타겟으로 하는 혁신적인 기술로 전장 유전체 시퀀싱에 비해 매우 경제적이다고 알려져있다. 비용대비 효과가 가장 크며, 암 및 생활성 습관 질환 관련 유전자 발굴에 효과적으로 적용할 수 있다.
엑손(exon)은 전체 게놈의 1%를 해석하는 경우 엑손과 인트론(intron)으로 나뉠 때의 의미이고, 엑솜(exome)은 모든 단백질 암호화 영역으로 전체 엑손(약 18만 개 정도)을 묶어서 표현하는 용어이다.
전장유전체 시퀀싱 : 전체 게놈을 시퀀싱하는 방법으로 참조 서열이 없거나 복잡할 경우 드노보(De novo)방식, 참조 서열이 존재하면 리시퀀싱(reseqeucing)방식으로 진행한다.
차세대 시퀀싱 기술(NGS) : 예전의 생어시퀀싱 기술보다 빠르고 간편하게 시퀀싱이 가능하여 시퀀싱 분야의 신기술로 급부상하고 있다. 시간, 비용적 절감에서 효율성을 극대화하는 차세대 신 기술이다.
ENCODE 프로젝트 : DNA 게놈 백과사전을 만들고자 80%의 밝혀지지 않은 게놈에 대한 기능을 연구한 프로젝트이다. 정크 DNA라고만 알려졌던 영역들이 질병에 영향을 미치는 유전자 스위치에 대한 유전자 지도를 만들고, 더 많은 생물학적 기능을 수행하는 위치들을 확인하는 프로젝트로 지난 9월 발표되었다.
단일 염기 다형성(SNP) : 개개인의 0.01%의 염기순서의 차이. 이 차이에서 인종이나 개인차, 질병 등이 유발되는 부분. SNP에 대한 연구가 진행되면 개개인의 체질에 맞는 새로운 주문제작 형태의 의료가 가능할 것으로 기대된다.
Indel : 유전자 서열에 아미노산의 삽입과 삭제
copy number : 단일 세포에 있는 플라스미드 분자의 수
BWA, BWT : 게놈 조립 도구 종류
생어시퀀싱 : 초창기 시퀀싱 방법으로 DNA 이중나선을 복제할 때 특정 염기에서 더 이상 복제가 일어나지 않고 끝나게 해, 끝 부분을 비교해 읽어내는 방식이다.
전사체 시퀀싱(RNA-seq) : 특정한 조건 하에 있는 세포 및 조직에서 발현되는 mRNA, 비단백질 코딩 RNA들을 모두 포함한 전사체의 총체를 시퀀싱하는 방법. 유전자 구조와 기능 연구에 기초가 되는 방법이다.