글리슨점수에 따른 전립선암의 차이는?

　

  글리슨 점수(GS, Gleason score)는 전립선암의 악성도 분류체계로 사용되는 지표이다. 전립선암이라고 해서 모두 동일한 질병 진행 과정을 보이지는 않는데, 이는 암의 악성도에 상당히 영향을 받기 때문이다. 어떤 전립선암은 처음부터 악성도가 높아 진행이 상당히 빠르기도 하며, 이에 따라 예후도 다르다.

 

   글리슨 점수(GS, Gleason score)란 조직검사 검체를 판독하는 병리의사들이 매기는 점수로서 떼어낸 전립선에서 암이 가장 많은 부분을 차지하는 두 군데에 점수를 각각 1-5점을 등급화(GP1-5, Gleason pattern1-5)하여, 이를 합한 점수를 말한다. 등급이 1점이면 정상에 가까운 분화를 나타내며, 악성도가 낮다. 하지만 5점이면, 정상세포의 모양을 보이지 않는 악성도가 가장 심한 암을 나타낸다. 이론적으로 두개의 글리슨 등급(GP)을 합한 글리슨 점수(GS)는 2-10점을 보이나 최근의 경향은 6점(낮은 악성도)이하, 7점(중간악성도), 8-10점(높은악성도)의 크게 세가지로 분류하고 있다.

 

  이 연구에서 대상이 된 글리슨 점수7의 전립선암(패턴 3, 패턴 4)은 글리슨 점수 6의 전립선암보다 훨씬 더 공격적인 종양을 예고한다. 따라서, 중간 악성도를 보이는 패턴 3과 그보다 악성도가 조금 더한 패턴 4를 대상으로, 이들의 종양세포 분자관계를 이해하고, 종양의 진행단계에 따른 질병의 분자 이상 연관성을 확인하는 것이 중요하다.

 

대상 및 분석 방법

  국립 암 연구소의 전립선암 샘플 14개를 대상으로 메이요클리닉의 진단 검사 의학 및 병리학 부에 의해 연구되었고, NIH에서 전립선 암 악성도 분류에 관련된 프로그램이 제공되었다.

  ① GP3과, GP4 전립선암에서의 DNA분리와, 라이브러리 구축 및 시퀀싱 

 

     냉동된 GS7인 전립선 암 14케이스를, 인접한 GP4와 GP3 연구를 위해 선정하였다.

     메이트 쌍 라이브러리는 메이트 쌍 라이브러리 준비 키트(Illumina)를 사용하여 제조하였다.
　

  ② 생물 정보학 분석

     각 샘플에서 최소 3 메이트 쌍에 포함된 break point이 추가 분석을 위해 수집되었다.

     클러스터링은 McQuitty 유사성 분석 방법을 사용하여 R 패키지 "hclust"기능을 사용했다.

     비교 관찰 중단의 농축이나 고갈의 의미는 이항 분포에 따라 계산 하였다.

  ③ PCR(polymerase chain reaction)과 생어 시퀀싱

 

      하나의 밴드가 적출 된, DNA를 추출하고, 생어 시퀀스는 3730 × 1 DNA 분석기에 해당하는 프라이머를 사용 하였다.

      혼합 풀 게놈 DNA 샘플은 정상적인 DNA 제어(Promega)로 사용되었다.

 

  ④ 면역 염색

 

      5 μm로 섹션한 조직을 희석한 뒤, 일차 항체의 응용 프로그램 (ERG 복제 9FY, Biocare 사) 을 거친 후, 30 분간 EDTA 함유된 항원 버퍼 에서 배양 하였고, 염색은 표준시약을 사용하였다.

 

   ⑤ FISH analysis

 

       FISH analysis 란, 분석을 감지하는 형광 프로브 (예 : DNA 또는 RNA 프로브)의 결합에 기초하고 복제 세균 또는 양식 진핵 세포의 염색체에있는 특정 DNA 서열의 존재여부를 찾아 내는 방법이다. FISH 연구는 PTEN 상태를 평가하기 위한 프로브를 사용하여, 포르말린으로 고정한 파라핀 조직에서 수행 하였다.

 

14명의 전립선 암 환자의 종양의 이질성 차이 (GP3, GP4)

  대규모의 시퀀싱이 이미 전립선 암에 적용되었지만, 이러한 연구 중 누구도 GP3에서 GP4로의 진행에 초점을 맞춘 연구를 진행한 적은 없었다. 여러 암의 전장 게놈 시퀀싱 결과, 종양은 많은 염색체 재배열 및 수천 개의 단일 염기변이(SNV)를 가지는 것으로 나타났다. 보통 조직 사이가 멀면, 찾을 수 없는 일반적인 변이들과, 개개인의 동일한 종양에서 다른 진행형태를 조사하였다.

 

  SNV는 정상 조직과 말초 혈액에서뿐만 아니라 종양에도 존재한다. 혈액과 인접하고 있는 체세포 종양의 발생 변화 연구에는 종양에서 먼 정상 조직의 추가 프로파일이 필요하다. 반면, 발암과 관련된 염색체 재 배열은 일반적으로 혈액 종양에서 발견되는 경우가 많다. 따라서 종양의 혈통을 연구하기 위하여, 우리는 같은 종양에 있는 다른 세포 집단 사이의 독특한 이상을 식별하는 pair 라이브러리 시퀀싱 방법을 이용했다.

 

　

  본 연구에서는 글리슨 점수7(GS7)의 전립선 암 14명의 사례를 분석하여, 다른 환자와의 종양에 대한 이질성을 발견했다. 재발성 염색체의 변화는 일반 및 특정 종양의 고유한 염색체 변화보다 적게 나타난다.

 

  염색체 재배열 연구는, 7개 결과에서 GP3와 GP4모두 염색체 배열의 유사한 패턴을 보였고 또한, 게놈 재배열 구간(break point)은 같은 종양 내 근접한 GP3와 GP4 사이에 관찰되었다. 마지막으로, 게놈 중단의 평가는 서로 다른 샘플의 종양 사이에서는 드물었으며, 같은 종양 내 근접한 GP3와 GP4에 일반적으로 나타났다.

 

맺음말

  글리슨 패턴(GP)과, 그 합계점수인 글리슨 점수(GS)는 전립선 암의 예후와 강력한 연관성을 가지고 있다. 글리슨 점수7 이상을 가진 사람은 예후가 좋지 않은 전립선 암을 가지고 있기 때문에, 암의 진행에서의 위험이 증가한다. 종양의 진행이 글리슨 패턴과 긴밀한 관계를 가짐에도 불구하고, 형태학적 이질성과 분자이성과의 관계가 정확히 밝혀지지 않았다.
　

  본 연구에서는 같은 종양 내의 다른 글리슨 패턴 사이의 염색체 재배열의 변화의 정도와 종양의 공통의 기원을 연구하였다. 인접한 글리슨 패턴 종양들 사이의 혈통 관계를 조사하기 위하여, 같은 종양 내의 두가지 패턴을 대상으로, laser capture microdissection(LCM), 전체 게놈 증폭 (WGA), 및 대규모 병렬 차세대 시퀀싱 (NGS)를 실시하여, 종양의 분자적 변화를 면역 염색법을 통한 추정관찰로 수행하였다. 또한 같은 종양 내 다른 패턴간의 종양연구와, 서로 다른 전립선암 환자의 종양 사이의 차이를 연구하였다.

 

  이번 연구는 GP3과 GP4처럼 특이성이 작은 진행단계에 따른 종양 샘플의 차이를 알 수 있게 하는 독특한 접근방식을 사용하여, 동일한 종양 내에서 인접한 GPS(글리슨패턴, 스코어)에 따른 염색체의 변경을 검토하는 최초의 연구이다. 같은 종양 내의 인접한 GP3와 GP4는 각각의 고유 한 break point를 가지고 있지만, 그들은 또한 공통기원의 동일한 것들을 공유한다는 것을 알 수 있다. 이러한 혈통 기원의 관계를 정의하는 것은 조양의 진행에 대한 이해에 도움이 된다.

 

  결론적으로, 이 연구는 GS7 전립선 암 사이의 더 나은 게놈 차이를 정의하기 위하여, 독특한 생물 정보학 알고리즘의 LCM, NGS를 사용하였고, 대부분의 경우, 같은 종양 내 GPS는 공통의 기원을 보였다. 같은 종양에서의 GPS는, 서로다른 두개 종양샘플에서의 같은 GPS 보다 서로 더 비슷했다. 이러한 결과는, 전립선 암의 진단에서 발견된 분자 마커의 사용을 결정하는 데에 도움이 될 것이다.

 

참고문헌

Lineage Relationship of Gleason Patterns in Gleason Score 7 Prostate Cancer

 

저자

글 : Jung.EunByoul

편집 : Park.HyeonJi, Ahn.Kung