Notice04 MALBAC

From PGI

Revision as of 01:02, 11 October 2022 by S (talk | contribs) (Created page with "= '''단일 세포에서 SNV와 CNV 감지''' =      인간의 유전정보는 23쌍의 염색체에 암호화 되어 있으며, 암이나, 진화 과정과...")
(diff) ← Older revision | Latest revision (diff) | Newer revision → (diff)
Jump to: navigation, search

단일 세포에서 SNV와 CNV 감지

 

   인간의 유전정보는 23쌍의 염색체에 암호화 되어 있으며, 암이나, 진화 과정과 같은 생물학적 과정에서 single nucleotide variation(SNV)과 copy number variation(CNV)와 같은 변이가 발생하게 된다.

 

  Single nucleotide variation(SNV)단일 염기의 차이를 보이는 변이로, 다중 변위 증폭(MDA; Multiple displacement amplification) 방법을 통해 식별할 수 있다. Copy number variation(CNV)참조 유전체와 비교해서 copy number의 차이를 보이는 1kb 이상의 DNA 조각을 의미한다. 염색체에서 SNV와 CNV는 진화와 암 등의 생물학적 과정의 원동력이 되며, 유전체의 특성을 나타내는 지표가 된다.

 

   DNA 변이 감수성이 낮으면, 염기서열 비교에 어려움을 겪는다. 이런 어려움을 해소하기 위해단일 세포의 유전체 염기서열을 편향성 없이 균일하게 알아낼 수 있는 새로운 방법을 발견했다는 소식이 Science지에 실렸다. 

 

 

중합효소연쇄반응의 편향성

 

  전통적인 유전체 염기서열 분석 방법은 충분한 양의 DNA를 제공하기 위해 수천 개의 세포들을 필요로 하며, 이것은 몇몇 세포들에 있어 작은 변동이 있을 수 있음을 의미한다. 하버드대학 생화학 연구자들이 개개의 세포에서 DNA의 염기서열을 효과적으로 분석할 수 있는 새로운 기술을 개발했다.


  NGS 기술의 급속한 진보로 단일 세포의 전체 유전체를 해독하기 위해, 낮은 빈도의 유전체 증폭하는 기술이 필요했다. 단일세포에 대한 유전체 분석은 해독을 위해, 필요한 DNA의 수를 늘리는 중합효소연쇄반응(PCR; Polymerase chain reaction)가 수행된다. 이러한 방법은 연구자들로 하여금 40~70%의 정확도로 해당 세포의 유전체를 분석할 수 있게 해 주지만 PCR이 지닌 편향성, 즉 유전체 염기서열 내의 일부 부분들이 다른 부분들에 비해 더 쉽게 증폭된다는 점 때문에 더 이상의 정확도를 기대하기가 어렵다는 문제가 있다. 이러한 사실은 해독될 수 있는 유전체의 양을 줄일 뿐만 아니라, 이용되는 DNA들이 탐지가 어렵거나 심지어는 어디에 있는 찾지 못하게 될 수도 있다는 단점이 있다.



MALBAC 기술 개발

 

   논문에서, 연구자들은 증폭과 관련된 문제를 해결할 수 있는 새로운 방법을 개발했다. 하버드대의 X.Sunney Xie 교수가 이끄는 연구팀은 MALBAC(multiple annealing and looping-based amplification cycles)라고 하는 기술을 개발했다. 이 방법에서는 세포로부터의 유전체들이 우선 분리된 후, 짧은 가닥의 DNA로 이루어진 프라이머들(primers)이 첨가된다. 첨가된 프라이머들은 이 DNA에 결합하게 되면 유전체의 93% 가량이 해독 되는데, 그 이유는 DNA와 결합한 일반적인 27개 염기서열로 이루어진 DNA 조각들이며, 그들 스스로 다시 루프(loop)를 이루기 때문이다. 

 

1. 단일세포로부터 추출된 DNA를 94°C에서 단일 가닥의 DNA로 분리 시킴.

2. MALBAC 프라이머와 기타 증폭 효소를 넣은 뒤, 특정온도 조건(0°C /65°C /94°C )을 반복하여 노출시킴

3. 염기서열이 상보적으로 Amplicon looping

4. 끝 부위의 꼬인 DNA는 hybridize -> 편향적 증폭 주의



균일적 증폭이 가능하다

 

   본 연구에서는 암 세포(SW480)의 DNA를 MALBAC 기술을 사용하여 편향성 없이 균일하게 증폭하여 25배수로 전장유전체 해독에서 93%가 매핑되었다. MALBAC를 이용한 균일적 증폭을 보여주는 것으로, A는 염색체 1번을 히스토그램이다. 로렌츠 곡선으로 특정 유전체의 누적 분율을 통해 균일적 증폭을 평가하는 것이고, C는 유전체 증폭에 따른 스펙트럼 밀도를 나타낸 것이다(그림은 논문 참고).

 

  하나의 암 세포에서 다중 변위 증폭(MDA; Multiple displacement amplification)에 의해 SNV를 식별하는 데 두 가지 문제점이 발견되었다. 하나는 환경오염에 의한 것으로, 자외선이나 미세유체(microfluidic)를 이용하여 해소할 수 있다. 다른 하나는 낮은 검출력에 의한 것으로, 단일 세포를 증폭하는 방법을 다양하게 하여 비교해 보았다. 다수 세포를 증폭한 것(bulk)과 단일 세포의 다중 변위를 증폭한 것(MDA), 그리고 단일 세포의 다중 풀림과 꼬임 기반의 증폭 방식(MALBAC)을 비교한 것으로 SNV 검출 효율 면에서 MALBAC가 가장 높았다. 두세 가지 세포를 이용하여 전체 SNV와 새롭게 발견된 SNV를 MALBAC로 확인한 내용이다.

 

  암 세포의 돌연변이 비율 측정과 새로운 SNV 측정 결과를 보여주는 것으로, A는 실험 디자인을 나타낸 것이고, B는 P값을 3차원으로 나타낸 plot이다. C는 단일 세포의 염색체에서 35개 새로운 SNV 위치를 나타낸 것이고, D는 NGS를 통해 새로운 SNV를 확인한 것이다. 마지막으로 E는 생어시퀀싱 데이터로 재확인한 것이다. 35개 SNV가 20세대를 거치면 이형 SNV가 72%, 49개 변이로 확인되며, 암 세포 돌연변이의 속도는 10배 빨라진다.

 

 

맺음말

 

  단일 세포 속에 존재하는 유전체 염기서열 분석의 개선은 매우 중요한 의미를 지니지만, 단일 염기서열에서 존재하는 오차는 여전히 무시되고 있다. 복제를 하는 방법 또한 복제 에러가 존재할 수 있는 것이다. CNV와 SNV의 특성을 이용하여 MALBAC는 개별성, 이질성, 단일 세포의 유전체 역학을 밝힐 수 있다.

 

  단일 세포에서 유전체의 염기서열을 분석하는 방법은 개별 세포에 존재하는 DNA의 서열을 비교 분석할 수 있기 때문에 암 치료를 도울 수 있다. 또한, 감식과학 분야에도 이러한 기술은 많은 도움을 줄 수 있을 것이다.

 

 

참고문헌

 

Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell

http://web.ebscohost.com.access.ewha.ac.kr/ehost/external?sid=b448cd1c-5055-4023-8ac0-0de8495c68f3%40sessionmgr12&vid=2&hid=19

Noninvasive whole-genome sequencing of a human fetus.

http://stm.sciencemag.org.access.ewha.ac.kr/content/4/137/137ra76.abstract?ijkey=b99d428500d842138baf4df7aca777a5b15f4c69&keytype2=tf_ipsecsha

Direct, genome-wide assessment of DNA mutations in single cells.

http://nar.oxfordjournals.org.access.ewha.ac.kr/content/40/5/2032.abstract?ijkey=073d4f7a7ee38e4e2e9f95a947e09dbaf7b711bd&keytype2=tf_ipsecsha

 

 

저자

 

글 : Park.HyeonJi

편집 : Lee.SeungYoun

키워드 : MALBAC(multiple annealing and looping-based amplification cycles), Single nucleotide variation(SNV), Copy number variation(CNV), 다중 변위 증폭(MDA; Multiple displacement amplification), 중합효소연쇄반응(PCR; Polymerase chain reaction) 등